活体荧光成像不仅是临床前研究中的一项常用影像技术，而且在近年来也逐渐被应用在临床手术中。经静脉或淋巴系统性递送的特异性荧光探针可以在荧光成像模式下点亮疾病发生的部位，而无需事先了解病灶的位置。例如，利用吲哚菁绿作为荧光探针的一种手术导航方式已经在肝癌转移灶的切除和乳腺癌前哨淋巴结的清扫等方面提供了实质性的临床益处。然而，这些荧光探针的荧光是不可控的，常常因非特异性结合作用增加荧光背景，导致灵敏度不足。与之相比，可激活的荧光探针对疾病进展中的生物标志物，如蛋白酶、活性氧物种、弱酸性、低氧等有特异性反应之后才发光，可以减少因脱靶造成的背景信号，从而进一步提高成像对比度。然而在实际情况中，由于体内复杂和异质的生理环境，可激活的这一初衷通常在诊断多种疾病的能力方面受到损害和限制。尤其是，大多数探针倾向于与血液中无处不在的生物大分子（如血清白蛋白、脂蛋白）非特异性结合，这可能会触发不需要的血液荧光背景并使探针的药代动力学复杂化，导致在病灶部位中的保留时间较短。更重要的是，目前可用的可激活探针主要发射可见光（VIS；400-700 nm）和近红外（NIR-I；700-900 nm）信号，这些信号可能会因组织异质性和深度位置而显著衰减，进一步降低了成像的对比度。

　　研究团队报道了一种细胞内吞激活的近红外二区荧光探针，在活体小鼠的肿瘤和踝关节损伤炎症的诊断方面获得了高对比度的成像效果，有望为多种疾病的临床前研究、临床诊断和手术导航提供新的解决方案。

二区细胞内吞激活荧光探针的作用机制示意图

　　溶酶体是细胞内吞过程末端的酸性细胞器（酸性pH在5-6左右），其中的物质被脂质膜包围，其间高密度分布的酸性水解酶和分解代谢物（如游离脂肪酸和脂质）产生强烈的非共价相互作用环境。那么是否可以设计一种荧光探针只针对溶酶体这一特殊细胞内环境而开启，从而有效的避免血液背景荧光的干扰，提高病灶部位的成像对比度呢？

　　近年来的研究表明，由于组织散射和自发荧光的降低，在波长为1000-1700纳米的近红外二区窗口成像可以显著提高成像清晰度和信噪比。研究团队首先从苯并噻喃菁和苯并吡喃菁两种近红外二区荧光染料母体出发，通过区域选择性地引入具有溶酶体定位和酸性响应功能的哌嗪基团，分别构建了4个波长不同的近红外荧光探针。近红外二区细胞成像结果表明，4个探针均具有良好的溶酶体定位与染色能力。其中最大发射波长达到近红外二区且在溶酶体酸性条件下具有较大荧光响应幅度的Lyso1005探针被选为模型探针进行了后续的改良设计。

图 1溶酶体激活与定位的近红外二区荧光探针的构建

　　研究人员合成了具有炔基官能团的Lyso1005探针，并通过点击化学方法进一步修饰了亲水性的聚乙二醇寡聚物。得到的探针被命名为CEAF（CellEndocytosis-Activated Fluorescent）探针，具有两亲性结构，在水溶液中因聚集而发生显著的荧光淬灭，而当加入微量的表面活性剂Triton X100即可使探针重新恢复荧光，并且在溶液酸性达到pH = 5的情况下进一步产生荧光增强效应。整个过程总的荧光增强倍数达到了72倍，比未修饰的Lyso1005探针提高了17倍。此外，体外成像表明，探针在血浆、组织模拟液、细胞培养液等环境下均不能产生荧光，但细胞成像结果表明，CEAF探针可以选择性的在溶酶体中被点亮。这一特性促使研究人员认为，探针的临界聚集浓度受溶液中非共价相互作用和酸性pH的共同调控，其后被进一步利用实验证实发现：酸性环境可以有效地提高探针的临界聚集浓度，促使探针更容易在外界非共价相互作用下发生解聚。

图 2 两亲性细胞内吞激活荧光探针的构建及其细胞内选择性激活机制的研究

　　基于CEAF探针的溶酶体选择性激活特性，团队测试了其在肿瘤成像与手术导航中的应用。通过尾静脉注射CEAF探针，小鼠CT26肿瘤可以被持续点亮超过36小时，并且点亮期间的肿瘤/背景信号比值持续超过Rose判据（信噪比大于或等于5是判断某一信号是否为真实信号的判据）。活体显微成像进一步证实，CEAF探针的荧光只出现在血管外的肿瘤区域。这一特性在肿瘤手术切除过程中显得尤为重要，特别是在使用常亮探针作为对照组的手术导航实验中，切除肿瘤产生的血液外渗使得手术区域出现了大面积的荧光污染，影响了后续肿瘤位置的鉴别。

图3 红外二区细胞内吞激活荧光探针在肿瘤成像与手术导航中的应用

　　为凸显这一策略的通用性价值，研究团队又在CEAF探针的基础上进一步的修饰了RGD靶向基团，其可以与炎性M1型巨噬细胞上高表达的αvβ3受体特异性结合。通过构建小鼠踝关节损伤模型，研究团队发现CEAF-RGD探针不仅能够持续点亮关节损伤部位，而且可以对脾脏部位进行特异性的荧光成像。流式细胞术证实，损伤发生后，脾脏和关节损伤部位的M1型巨噬细胞均大量增多。上述结果表明了CEAF探针在细胞特异性成像方面的巨大潜力。

图4 红外二区细胞内吞激活荧光探针在细胞特异性的关节炎诊断中的应用

　　参考文献：

　　Yue He+, Shangfeng Wang+*, Peng Yu+, Kui Yan, Jiang Ming, Chenzhi Yao, Zuyang He, Ahmed Mohamed El-Toni, Aslam Khan, Xinyan Zhu, Caixia Sun, Zuhai Lei and Fan Zhang*. NIR-II Cell Endocytosis-Activated Fluorescent Probes For In Vivo High-Contrast Bioimaging Diagnostics. Chem. Sci., 2021, 12, 10474–10482.