近红外二区长波长窗口（NIR-II-L，1500–1900 nm）因光子散射最小化和信噪比显著提升，被认为是实现深层组织高分辨率成像的理想光学窗口。传统多路复用成像采用不同发射波长的探针，并在单一检测通道内切换光学滤光片以分离不同波长信号。这种方法虽具有广泛的探针兼容性，但牺牲了时间分辨率。多激发单发射系统通过相同发射波长和激发编码实现多路复用，可避免光学像差。镧系纳米颗粒因其丰富的能级和窄带发射特性，是实现不同激发波长下相同发射波长的理想候选者。当前NIR-II-L窗口的多激发单发射镧系纳米颗粒主要依赖Er³⁺基纳米颗粒（808/980 nm激发，1532 nm发射）。然而，由于水吸收（1400–1600 nm）与Er³⁺发射带（1450–1600 nm）部分重叠，其组织穿透深度难以进一步提升。相比之下，Tm³⁺基探针发射在更长的1632 nm波长处，远离水吸收带，可实现更强的组织穿透，基于Tm³⁺的双激发系统此前尚未被探索

研究团队开发了首个双激发（690和785 nm）比率型Tm³⁺纳米颗粒。通过引入最优量（0.5%）的Yb³⁺离子作为能量陷阱，在两种激光激发下分别实现了1632 nm发射的2.1倍和3.5倍亮度增强。得益于多激发单发射特性，该双激发比率成像在组织覆盖厚度从0增加至4.5 mm时，变异系数保持在10%以下。相比之下，NdNPs/TmNPs和HoNPs/TmNPs单激发多发射体系的比率值分别产生约360%和170%的波动，ErNPs/TmNPs体系虽因NIR-II-L区域较低的组织散射和自发荧光而误差减小，但仍存在98%的信号衰减。这一高保真比率荧光成像成为生物分析物动态定量的有效工具，实现了后肢缺血和再灌注过程中氧合血红蛋白饱和度的实时监测。

图1. (a) Ln ³⁺（Ln = Nd、Ho、Er或Tm）的发射光谱，水的吸收曲线和1%脂肪乳剂的散射曲线。

(b) 填充有LnNPs并被不同深度的1%脂肪乳剂覆盖的毛细管的示意图。

(c) 采用不同镧系纳米颗粒、双通道检测得到的毛细管比率型荧光图像。  

(d) 沿白线提取的归一化强度比值，随1%脂肪乳剂覆盖深度的变化曲线。

(e) 690 nm 与 785 nm 激发下，基于铥纳米颗粒（TmNPs）的腿部血管活体成像。

 (f) 图 e 中红色选线对应的荧光强度分布，以及计算得到的半高全宽与信噪比。

(g) 图 e 中铥纳米颗粒的比率荧光图像(I_Ex690/I_Ex785)。

 (h) 在图 g 中随机选取 10 个区域，统计其强度比值。。

构建了基于TmNPs的多激发单发射成像系统用于多路复用成像。设计了Tm³⁺掺杂纳米颗粒pTm（α-NaYbF₄:5%Tm/15%Y@NaYF₄），在980 nm激光激发下产生与TmNPs相同的NIR-II-L发射，展现出优异的信号隔离度。采用相同发射波长进行多路复用成像确保了不同成像通道间一致的成像分辨率。与传统的单激发多发射系统相比，多激发单发射系统避免了聚焦依赖的分辨率偏移。得益于各通道一致的聚焦状态，该多激发单发射成像系统保证了动态多路复用成像能力。消除了激发切换过程中的重新聚焦和滤光片切换，时间信号损失被有效最小化。研究团队制备了嵌入TmNPs、pTm或pEr的约5 mm PDMS微珠，通过频率调制系统交替激光激发（785和980 nm，50 ms曝光时间，10 ms延迟时间），实现了0.12 s时间分辨率的双通道多路复用成像，在10.92 s内捕获92帧运动图像。轨迹重建显示NIR-II-L成像与明场视频高度一致，相对位置的定量比较显示各时间点差异极小。相比之下，传统单激发多发射系统（pTm/pEr对）需要机械滤光片切换和重新聚焦，仅能捕获4帧，导致显著的轨迹偏差和位置误差。

图2. (a) HbO 2、HbR和TmNPs的吸收光谱。

(b) 小鼠血样血氧饱和度（sO₂）与I_Ex690/I_Ex785的对应关系，据此建立经验校准公式。

(c) 缺血模型示意图。注射铥纳米颗粒后，在不同时间点对缺血模型（上图）与非缺血对照组（下图）开展 NIR‑II‑L 比率型荧光成像。  

(d) 缺血组 ROI‑1~ROI‑3 区域对应的血氧饱和度随时间变化曲线；柱状图代表 0 s 与 64 s 时刻 ROI‑1~ROI‑3 的计算血氧饱和度。

(e) 未结扎血管的非缺血对照组中，ROI‑1~ROI‑3区域对应的血氧饱和度随时间变化曲线。

(f) 不同结扎时长下，缺血再灌注的时间线。

(g) 血管结扎 15 min、215 min 后缺血再灌注的 NIR‑II‑L 比率荧光图像；

 (h) 选定 ROI‑2 区域（白色方框内）对应的血氧饱和度随时间变化曲线。

(h) 中性粒细胞向被滞留的间充质干细胞周围迁移的最大强度投影（MIP）图像。

该研究成功构建了基于Tm³⁺的多激发单发射系统。利用Tm³⁺离子丰富的能级，研究团队开发了以Yb³⁺为能量陷阱的自敏化高掺杂Tm³⁺纳米颗粒，在690和785 nm激发下分别实现了1632 nm下转换发射的2.1倍和3.5倍增强。该设计实现了组织穿透深度达4.5 mm的稳定比率荧光成像，在后肢缺血再灌注小鼠模型中展示了高保真实时活体定量能力。此外，TmNPs与pTm的联合使用实现了无彩色像差的多路复用血管和淋巴管/淋巴结成像，无需重新聚焦，提升了动态多路复用成像的时空分辨率。与传统多发射探针相比，TmNPs利用镧系离子的多能级特性，从单一发射体中选取不同激发峰，构建了尺寸小（约20 nm）、发射波长长（1632 nm）的明确核壳纳米颗粒，展现出稳定的比率信号、良好的生物相容性和深层组织穿透能力，使其更适合于生物传感和体内成像。

参考文献：

J. Xu, J. Ming, M. Yang, H. Liu, L. Yang, Z. Chen, J. Li, X. Wang, Y. Fan, F. Zhang. Highly Doped Tm³⁺ Nanoparticles with Efficient 1632 nm Emission Enable High‑Fidelity Multiplexing In Vivo Bioimaging. Nano Lett. 2026, 26: 3171−3180. https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.5c06370.