近红外二区荧光多重成像技术可以同时对活体深层组织内的两个或者多个生物过程进行定性和定量的研究，因此，对于科研人员更好的理解疾病的发生机制、进行药物的筛选以及临床上的精确诊断具有重要的意义。然而，由于缺乏在水溶液中具有完整吸收光谱以及良好光谱分离的高亮度近红外二区染料，活体深层组织下的近红外二区荧光多重成像具有很大的挑战性。

　　团队构建了一系列长波长的七甲川菁染料，并通过反离子配对策略有效增强了染料在水溶液中的光物理学性质。最后，通过结合反离子配对的染料和激发波长相匹配的激光器构建了近红外二区激发双色成像系统，并将该系统成功地用于同时成像小鼠的血液循环系统和代谢器官、肿瘤和肿瘤附近的血管系统、小鼠后肢的淋巴系统和血管系统。这是首次在活体深层组织内实现近红外二区激发和近红外二区发射的荧光多重成像。

　　图1：团队基于七甲川菁染料为母体设计了九种菁染料分子（命名为HC）。HCs染料是以吡喃或噻喃杂环为端基，中间以甲川共轭链相连，可以增加分子内的推拉电子效应，促使染料的波长红移。同时，当染料的杂原子由氧变成硫时，硫原子对核外电子的束缚能力减弱，导致染料的离域能力增强，迫使染料的波长红移。而且，端基五元桥环结构的引入不仅可以增加染料的光稳定性和化学稳定性，抑制染料的旋转，提高量子产率，而且还可以提供超共轭效应进一步迫使染料的波长红移。最后，通过在端基苯环上的不同位点修饰给电子的甲氧基，对染料的波长进行更细微的调节。通过对染料光物理学性质的研究发现其最大吸收/发射波长都位于近红外二区（1000-1700 nm），λmax，abs在1180-1312 nm的波长范围内可调，λmax，em在1222-1376 nm的波长范围内可调。

图1.（a-d）HCs染料的设计思路和分子结构；

（e）HCs染料的合成路线；

（f）部分HCs染料在DCE中的归一化吸收光谱；

（g）部分HCs染料在DCE中的归一化发射光谱。

　　图2：首先，为了阐明杂原子和甲氧基取代对HCs染料的电子和几何性质的影响，团队对染料进行了密度泛函理论（DFT）和含时密度泛函理论（TDDFT）计算。结果表明所有HCs染料的（S0→S1）能级与λmax，abs的变化趋势密切相关，而且染料都具有平面的多甲川骨架，但末端的杂环是非平面的。

图2.（a）计算出HCs染料的最高占据分子轨道（HOMOs）、最低未占据分子轨道（LUMOs）和S0–S1激发能（ΔE）；

（b）HCs染料的优化基态（S0）几何结构。

　　图3：随后，团队发现，和已经报道的近红外二区菁染料类似，HCs胶束在水溶液中表现出吸收光谱的衰减和变宽，以及荧光猝灭，这通常可以由ACQ效应和不对称偶极结构的形成来解释。为了解决这个问题，团队引入反离子配对策略，使用体积庞大的疏水反离子作为空间间隔物来阻止染料的聚集，也可以作为软离子来削弱极化。结果表明，反离子配对的染料在水溶液中表现出优秀的光物理性质，证明了其在生物成像方面具有潜在的应用价值。

图3.（a）HCs胶束和HC/F5-TPBs胶束的光物理性质示意图；

（b，c）HC1222和HC1342在DCE中的吸收光谱，以及负载1 wt% HCs、HC/TPBs和HC/F5-TPBs的胶束在水中的吸收光谱;

（d）吸收光谱的峰肩比；

（e）反离子（F5-TPB）交换前后染料胶束的亮度比较；

（f）HC1222/F5-TPB和HC1342/F5-TPB胶束归一化的荧光强度与染料负载量的关系；

（g）ICG（水中）、ICG-FBS复合物、IR1061胶束、HC1222/F5-TPB胶束和HC1342/F5-TPB胶束在808 nm激光照射（600 mW/cm2）下的归一化荧光强度。

　　图4：进一步，团队为了评估反离子配对的HCs染料的近红外二区激发成像性能，分别研究了模拟生物组织和真实生物组织中的光学穿透性能以及活体成像性能。结果表明反离子配对的染料胶束拥有更高的亮度。此外，小鼠的全身血管成像结果证明了反离子配对策略提高染料成像性能的有效性，为近红外二区激发的多重生物成像做好了准备。

图4.（a）HC1342/F5-TPB胶束在脂肪乳剂中的穿透实验示意图；

（b，c）HC1342/F5-TPB胶束覆盖2 mm小鼠肌肉组织后的成像示意图；

（d-k）小鼠大脑、背部、后肢和腹部血管成像示意图。

　　图5：最后，团队通过结合反离子配对的染料和激发波长相匹配的激光器构建了近红外二区激发双色成像系统，并将该系统成功地用于同时成像小鼠的血液循环系统和代谢器官、肿瘤和肿瘤附近的血管系统、小鼠后肢的淋巴系统和血管系统。

图5.（a）HC1222/F5-TPB和HC1342/F5-TPB的归一化发射光谱以及1200-1300 nm通道（红色）和1450-1700 nm（青色）通道的伪彩色图像；

（b）代谢系统双色成像的示意图；

（c）肿瘤小鼠的双色成像示意图；

（d）沿c中黄色虚线的横截面荧光强度分布；

（e）淋巴管和后肢血管的双色成像示意图；

（f）沿e中黄色虚线的横截面荧光强度分布。

　　团队共设计合成了九个具有近红外二区发射的七甲川菁染料，并通过反离子配对策略增强了染料在水溶液中的光物理学性质。通过结合反离子配对的染料和激光器构建了近红外二区激发双色成像系统，并将该系统成功地用于同时成像小鼠的血液循环系统和代谢器官、肿瘤和肿瘤附近的血管系统、小鼠后肢的淋巴系统和血管系统，首次在活体深层组织内实现近红外二区激发和近红外二区发射的荧光多重成像。该研究拓展了荧光多重成像的能力，为活体深层组织内的生物医学成像提供了新的机会。

　　参考文献:

　　Yang Yang#, Caixia Sun#, Shangfeng Wang*, Kui Yan, Mengyao Zhao, Bin Wu and Fan Zhang*. Counterion-paired Bright Heptamethine Fluorophores with NIR-II Excitation and Emission Enable Multiplexed Biomedical Imaging. Angew. Chem. Int.Ed. , 2022, 61, e202117436.